液相色譜法測定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛

血紅蛋白氧載體(Hemoglobin basedoxygencarriers，HBOCs)是血液替代品中熱點研究領(lǐng)域之一[1,2]。其常用的一種制備方法是以多醛基分子為交聯(lián)劑，如戊二醛，開環(huán)棉籽糖等將血紅蛋白交聯(lián)制備而成[3，4]。游離的戊二醛有一定的毒性，在臨床使用前必須除去。

檢測醛類氣相色譜[5～7]具有較高的分析速度，但是靈敏度相對較低[8]。液相色譜被廣泛應(yīng)用于醛的測定[9～11]，在測定戊二醛時，顯示出更高的靈敏度[8]。

在液相色譜法中，2,4?二硝基苯肼(2,4?dinitrophenylhydrazine,DNPH)柱前衍生法是測定醛基的強有力的工具之一。文獻(xiàn)報道大多是測定空氣中戊二醛的污染，未見測定血紅蛋白氧載體中戊二醛的報道?！渡镏破芬?guī)程》中測定無細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗中戊二醛的方法[12]不能直接用于血紅蛋白氧載體中戊二醛的測定，需要對樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，且線性關(guān)系較差。因此,本實驗對測定血紅蛋白氧載體中殘留戊二醛的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，包括SCL 10Avp控制器，SPD?10Avp檢測器，LC 10Atvp雙泵，DGU?10A脫氣系統(tǒng)，CTO 10Asvp柱溫箱，Class vp工作站;CBN8?30恒溫水浴(丹麥Heto公司)。5804R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，10kDa超濾膜(美國Millipore公司)，SigoTCI?Ⅱ恒流泵(北京思路高公司)，KL?UP?Ⅱ20超純水機(jī)(臺灣艾柯公司)。2,4二硝基苯肼(98%)、HClO4、25%戊二醛(w/w)購自Sigma公司，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)。

2.2實驗方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取2.3760gDNPH，用20%HClO4溶解并定容至100mL,配制成濃度為120mmol/L的貯備液，用20%HClO4稀釋至30mmol/L作為工作液。

2.2.2無基質(zhì)血紅蛋白(Stroma?freehemoglobin,SFH)的制備SFH的制備程序參見文獻(xiàn)[13]的方法。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線將戊二醛分別稀釋成0.1，0.5，1，2，4，6，8和10mg/L，分別取0.5mL于5mL離心管中，加入1.4mL乙腈，再加入0.1mL120mmol/LDNPH，會于混旋器上混合均勻，反應(yīng)30min后，用有機(jī)濾膜過濾后，上樣20μL進(jìn)行分析。

2.2.4血紅蛋白的聚合過程中戊二醛的測定血紅蛋白的聚合參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，取80g/LSFH50mL，用恒流泵逐滴加入適量的戊二醛(n(SFH)∶n(戊二醛)=1∶10)，待滴加完畢，聚合反應(yīng)4h后，加入1.0mol/L甘氨酸(終濃度0.1mmol/L)進(jìn)行終止，1h后，加入還原劑二甲胺基硼烷(DMAB)進(jìn)行還原(n(戊二醛)∶n(DMAB)=1∶6)，反應(yīng)1h后，用Ringer′s液作為透析液透析24h，每6h換液一次，共換液4次。4℃保存15d，各取5.0mL加入到2個超濾膜(10kDa，Millipore)中[15]，在4℃以3000r/min離心20min，取下層液體0.5mL,按2.2.3步驟進(jìn)行衍生并測定。

2.3色譜條件

Shim?packVP?ODS色譜柱(250mm×4.6mmi.d.,5μm，孔徑12nm,日本Shimadzu公司);流動相：70%乙腈，流速1.0mL/min;檢測波長：360nm。

3結(jié)果與討論

3.1目標(biāo)產(chǎn)物的確定

戊二醛有2個醛基，與DNPH反應(yīng)后生成的DNPH?one有3種可能的異構(gòu)體：順?順、順?反、反?反異構(gòu)體。圖1為標(biāo)準(zhǔn)戊二醛衍生后的色譜圖。圖1在乙腈體系中衍生的2,4?二硝基苯腙的色譜圖

Fig.1Chromatogramof2,4?dinitrophenylhydrazine(DNPH)?ones.Themobilephaseis70%acetonitrile

峰(peak)1.過量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2,3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer).有2個明顯的目標(biāo)峰(峰2與3)，應(yīng)該為DNPH?one的其中兩種異構(gòu)體，具體為哪一種異構(gòu)體還有待于進(jìn)一步鑒定，第3種異構(gòu)體沒有觀測到的原因可能是由于異構(gòu)體之間結(jié)構(gòu)非常相似，第3種異構(gòu)體保留時間和另外兩種異構(gòu)體的其中一種相同，也可能是第3種異構(gòu)體的含量特別少，很難觀測到。在一定范圍內(nèi)用不同濃度的反應(yīng)物進(jìn)行分析，該峰2和峰3的峰面積都和戊二醛濃度之間有良好的線性關(guān)系，都可用于定量研究。分析化學(xué)第37卷第10期嚴(yán)坤平等：液相色譜法測定血紅蛋白氧載體中殘留的戊二醛

3.2色譜條件的優(yōu)化

在酸性情況下，用過量的DNPH充分和醛基反應(yīng)，此反應(yīng)的產(chǎn)物2,4?二硝基苯腙在水中的溶解度較小，而在乙腈中的溶解度較大，圖2在50%乙腈體系中進(jìn)行衍生的2，4二硝基苯腙樣品過濾前(a)后(b)色譜馱比

色譜條件和圖1相同(OtherconditionsarethesameasdescribedinFig.1).峰(peak)1.過量的DNPH(ExcessDNPHreagent);峰(peak)2，3.DNPH?ones異構(gòu)體(DNPH?oneisomer)。直接在水中反應(yīng)或在乙腈比例較小時會使生成的產(chǎn)物產(chǎn)生沉淀。將6.0mg/L戊二醛在50%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物用70%乙腈進(jìn)行分離，如圖2a所示，可以看出2，4二硝基苯腙的色譜峰有明顯的拖尾，而將產(chǎn)物過濾后上樣(圖2b)，則色譜峰無拖尾現(xiàn)象，這說明拖尾是由于沉淀在吸附在色譜柱上，隨流動相中重新溶解后再被洗脫下來的緣故。而若將6.0mg/L戊二醛在70%乙腈水溶液中衍生，產(chǎn)物仍用70%乙腈進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物過濾和不過濾譜圖結(jié)果完全相同，都無拖尾現(xiàn)象。實驗證實，戊二醛濃度達(dá)到10.0mg/L時，在70%乙腈水溶液中衍生不會產(chǎn)生沉淀。本實驗室采用文獻(xiàn)[12]的方法測定血紅蛋白氧載體中的戊二醛時，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系較差，這就是由于采用的乙腈濃度太低，在衍生較高濃度的戊二醛(>6.0mg/L)時就會有沉淀產(chǎn)生，沉淀被過濾后導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確。因此，衍生反應(yīng)應(yīng)該在乙腈比例較高的溶液中進(jìn)行，而且盡可能和流動相比較接近，在70%乙腈溶液中進(jìn)行衍生可滿足10.0mg/L以下戊二醛的衍生。流動相中乙腈的比例越大，衍生物洗脫時間就越短，峰形更為尖銳，相應(yīng)的靈敏度也越高，但是，洗脫時間太短，過量DNPH及雜質(zhì)的洗脫峰會干擾衍生物的洗脫峰，綜合考慮，以70%乙腈溶液為流動相較好。

3.3衍生條件的優(yōu)化

在優(yōu)化衍生條件的實驗中，全部采用1.0mg/L戊二醛為分析物濃度，峰面積以靈敏的峰3計算。

3.3.1DNPH和戊二醛的摩爾比DNPH和戊二醛反應(yīng)生成希夫堿，該反應(yīng)不能進(jìn)行完全，因此通常采用過量的DNPH對戊二醛進(jìn)行衍生，盡可能將戊二醛定量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的腙。本實驗在n(DNPH)∶n(戊二醛)為2∶1～120∶1的范圍內(nèi)研究了戊二醛的衍生反應(yīng)。實驗表明，在70%乙腈，pH=1.0,在20℃反應(yīng)30min的條件下，隨著DNPH濃度的增大，衍生物的轉(zhuǎn)化率也逐漸增大，當(dāng)n(DNPH)∶n(戊二醛)≥60∶1時，轉(zhuǎn)化率基本保持不變，此條件可以作為定量分析的條件。本實驗采用n(DNPH)∶n(戊二醛)=60∶1進(jìn)行衍生。

3.3.2pH值在乙腈中，HClO4比HCl的溶解性更好[16]，因此，本實驗采用HClO4調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸度。為了操作和計算方便，近似認(rèn)為[H ]≈[HClO4]。本實驗在上述條件下改變pH值，研究了pH值對衍生反應(yīng)的影響。如圖3所示，pH1.0時，戊二醛的衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

圖3pH對衍生效率的影響

Fig.3EffectsofpHofmediumonconversionefficiencyofglutaraldehydetoitsDNPH?onesn(DNPH)∶n(戊二醛，glutaraldehyde)=60∶13.2.3反應(yīng)溫度分別在0，10，20和30℃的條件下研究了溫度對衍生反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果各溫度下衍生物的峰面積分別為166702，184363，187247，180590，除在0℃下面積略小外，其余溫度下的面積均非常接近，說明在10～30℃的范圍內(nèi)反應(yīng)基本不受溫度影響。因此，本實驗在室溫下進(jìn)行。

3.2.4反應(yīng)時間在80min內(nèi)研究了反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間的延長，轉(zhuǎn)化效率逐漸增大，在反應(yīng)20min后，衍生反應(yīng)達(dá)到平衡，衍生產(chǎn)物的濃度基本保持不變。為保證本方法的耐用性，衍生時間選擇30min。

3.3工作曲線、檢測限和精密度

戊二醛濃度在0.1～10mg/L范圍內(nèi)與單峰面積呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109306x-7405.1，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9999，而如果采用文獻(xiàn)[12]的方法，r<0.99。逐稀釋樣品，進(jìn)樣20μL，當(dāng)信噪比為3時，戊二醛所對應(yīng)的濃度為0.05mg/L，即檢出限為1.0ng。以1.0mg/L戊二醛進(jìn)行衍生，平行6份，每份樣品各測定一次，每次進(jìn)樣20μL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.0%。
　　
3.4標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定回收率。各取終產(chǎn)品5.0mL，分別加入到兩個10kDa的超濾膜中，在4℃以3000r/min離心10min，合并下層超濾液后取0.5mL，加入0.5μg(10μL0.05g/L)戊二醛，平行5份，按照2.2.3節(jié)進(jìn)行衍生。另取0.5mL超濾液按照2.2.3節(jié)直接進(jìn)行衍生，平行5份作為空白對照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入實驗，計算得平均回收率為95.3%。

戊二醛作為交聯(lián)劑直接加入終產(chǎn)品中再次會引起聚合反應(yīng)，所以上述測定回收率的方法是在超濾液中加入戊二醛進(jìn)行測定，為考慮超濾膜是否對戊二醛產(chǎn)生吸附，進(jìn)行了下述兩個實驗，取0.10mg/L戊二醛，(1)同樣品處理方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行色譜分析;(2)直接進(jìn)行衍生后進(jìn)行色譜分析;兩個實驗各平行10份，對兩者峰面積平均值在顯著性水平為0.05的情況下進(jìn)行差異顯著性檢驗，結(jié)果兩者無顯著性差異，說明超濾膜對戊二醛基本無吸附，不會對回收率造成影響。

3.5終產(chǎn)品中戊二醛的測定

戊二醛和血紅蛋白的胺基反應(yīng)后生成希夫堿結(jié)構(gòu)，希夫堿經(jīng)過還原后，生成穩(wěn)定的CN單鍵，但是，希夫堿是否能被還原還不清楚，如果沒有完全還原，由于生成希夫堿是可逆反應(yīng)，在一段時間后，沒有被還原的希夫堿會分解產(chǎn)生戊二醛，可以用本方法測定解離下來的戊二醛。本方法應(yīng)用于終產(chǎn)品中殘余戊二醛的測定，戊二醛濃度低于檢出限